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阿維菌素發(fā)酵過程糖含量測定三種方法比較

　　摘要：三種常用方法測阿維菌素發(fā)酵過程糖濃度,比較得出阿貝折光儀法操作簡單、快捷、準確，能夠控制發(fā)酵液糖的含量，利于發(fā)酵過程控制。

　　關(guān)鍵詞：阿維菌素;阿貝折光儀;糖含量

　　The Comparison of Three Methods on Measuring the Sugar Content of Abamectin Fermentation Process

　　Abstract: Comparing three methods on the sugar content of abamectin fermentation process,abbe refractometer method is simple ,fast, accurate,and able to control the sugar content of fermentation,which will conducive to the fermentation process control.

　　Keyword: abamectin; abbe refractometer; sugar content

　　阿維菌素是一種農(nóng)用獸用殺蟲、殺螨劑，大環(huán)內(nèi)酯雙糖類抗生素化合物。由阿佛鏈霉菌經(jīng)二級生物發(fā)酵、化學(xué)提取、精制而成;阿維菌素的發(fā)酵工藝是通過一系列工藝參數(shù)來實現(xiàn)的。這些參數(shù)中包括一是物理參數(shù)，即溫度、壓力等,二是化學(xué)控制參數(shù)，即pH、糖的濃度等;其中糖的濃度是控制發(fā)酵過程中的重要參數(shù)之一;由于碳源對于發(fā)酵過程菌體生長及阿維菌素合成都有較大影響。因此，測知發(fā)酵過程中糖濃度變化，對阿維菌素發(fā)酵控制有重要的指導(dǎo)意義，因為糖濃度變化影響菌種在發(fā)酵過程阿維菌素效價的變化，效價是發(fā)酵產(chǎn)量重要指標，效價低就意味著產(chǎn)量低。糖濃度低于控制指標，得不到及時補給，發(fā)酵液的菌絲就會生產(chǎn)緩慢甚至停滯生長，造成減產(chǎn)，為此對糖濃度檢測方法要簡便、快捷、準確，要及時滿足工藝要求。

　　測糖的方法有許多常用的有菲林法、3，5一二硝基水楊酸法(DNS)、阿貝折光儀。

　　測糖菲林法是在加熱條件下，直接滴定已標定過的費林氏液，費林氏液被還原析出氧化亞銅后，過量的還原糖立即將次甲基藍還原，使藍色褪色，溶液的顏色變化過程為：淺藍色一棕色一磚紅色(沉淀)，根據(jù)樣品消耗體積，計算糖含量。

　　3，5一二硝基水楊酸法(DNS)是在堿性溶液中，還原糖變?yōu)橄┒�，烯二醇可�?，5一二硝基水楊酸氧化為糖酸，加熱進一步產(chǎn)生一種棕紅色的氨基化合物，在540 nm波長處有最大吸收，在一定濃度范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)的深淺成一定比例關(guān)系。

　　阿貝折光儀測糖是利用光線折射的原理測定不同濃度糖的折光特性。

　　前兩種操作時間較長，步驟多，而且樣品要經(jīng)除去蛋白質(zhì)后再測，存在人為因素對顏色變化的把握，同時要作平行樣，影響及時補糖，滯后工藝控制。作者查詢文獻得知國內(nèi)青霉素發(fā)酵、四環(huán)素發(fā)酵過程采用阿貝折光儀測糖，為此受到啟發(fā)，作者引用該儀器來測定阿維菌素的發(fā)酵過程糖的濃度，經(jīng)過三種方法的對比試驗，發(fā)現(xiàn)該儀器測定方法完全適合阿維菌素發(fā)酵過程糖濃度測定。通過實驗證明阿貝折射法比菲林法、DNS測糖方法所用時間少，而且數(shù)據(jù)可靠，并能及時調(diào)整發(fā)酵過程中糖的濃度，滿足工藝要求。同時不需用化學(xué)試劑，減少對環(huán)境的污染，并節(jié)約了生產(chǎn)成本。

　　由于發(fā)酵工藝所需原輔料的質(zhì)量指標是根據(jù)工藝要求而定，所以質(zhì)量標準企業(yè)可按照工藝要求而自定企業(yè)內(nèi)部標準，生產(chǎn)中發(fā)酵液的各種測定只要方法簡捷、數(shù)據(jù)可靠，滿足工藝要求、符合企業(yè)標準即可。

　　1 實驗條件

　　1.1 儀器、設(shè)備、試劑

　　1.1.1 阿貝折光儀;潔凈工作臺;恒溫恒濕搖床;分光光度計721,阿維菌素發(fā)酵液：實驗室自;DNS法所用試劑：DNS顯色劑、有酒石酸鉀鈉、無水亞硫酸鈉、氫氧化鈉、3，5一二硝基水楊酸、葡萄糖、碘一碘化鉀;菲林發(fā)所用試劑：氫氧化鈉、硫酸銅、葡糖糖。

　　1.2 測樣條件

　　溫度25℃;純化水折射率1.3325;光源白光。

　　1.3 實驗部分

　　1.3.1 發(fā)酵液處理與測樣配制阿維菌素的發(fā)酵培養(yǎng)基(20100921，20100922 ，20100923)三批各60瓶，使用1000 mL的三角瓶，每瓶裝量為500 mL，消毒后溫度降至與發(fā)酵培養(yǎng)一致的溫度28℃，然后無菌接種，三批發(fā)酵液分別放置三臺搖瓶機進行發(fā)酵培養(yǎng),溫度、濕度、轉(zhuǎn)數(shù)控制在于生產(chǎn)工藝規(guī)定的范圍內(nèi)。所取發(fā)酵液樣用濾紙過濾到試管里，取濾液滴到折光儀測試點，并讀數(shù);同時按菲林法和3,5-二硝基水楊酸(DNS)測發(fā)酵液糖濃度。

　　1.3.2 樣品測定

　　1.3.2.1 折光法取過濾法后阿維菌素發(fā)酵液用干凈滴管加在折射棱鏡表面，并讀數(shù)。

　　1.3.2.2 菲林法吸取費林試劑甲液(0.1 g/mL氫氧化鈉溶液)及乙液(O.05 g/mL硫酸銅)各5.O0 mL，置于錐形瓶中，加蒸餾水10 mL，加玻璃珠3粒，從滴定管中加入比與測試樣品溶液消耗的總體積少1 mL的過濾后發(fā)酵液，加熱使其在2 min內(nèi)沸騰，準確沸騰30s，趁熱以每2s 1滴的速度繼續(xù)滴加樣液，直至藍色剛好褪去為終點。記錄消耗樣品溶液的總體積，平行操作取其平均值。

　　1.3.2.3 DNS法先繪制葡萄糖標準曲線，取適量阿維菌素發(fā)酵液于離心管中，3 500 r/min離心15 min，取上清液加人25 mL容量瓶中，加入DNS試劑5 mL沸水浴5 min，冷水冷卻后定容，以空白作對照測定520nm波長下的吸光度。

　　1.3.3 數(shù)據(jù)分析 連續(xù)三批阿維菌素發(fā)酵情況良好，發(fā)酵過程糖消耗速率正常，菌絲生長正常，將三批發(fā)酵在相同發(fā)酵周期內(nèi)，用三種不同方法測得糖含量數(shù)據(jù)分別進行統(tǒng)計，結(jié)果見表1。

　　根據(jù)實驗數(shù)據(jù)分別對三種方法進行相對標準偏差計算得出阿貝折光儀測糖相對標準差RSD是2.58%，菲林法相對標準差RSD是2.43%，DNS法相對標準差RSD是2.09%。

　　1.3.4 實驗結(jié)果 在同樣實驗條件下，得出阿貝折光法、DNS和菲林法對阿維菌素連續(xù)三批發(fā)酵液樣中糖含量的數(shù)據(jù)結(jié)果接近，沒有大的差異，RSD數(shù)據(jù)顯示三種方法的精密度與準確度都能夠保證阿維菌素發(fā)酵液的糖濃度含量，比較而言阿貝折光法時間短，只需3分鐘，操作簡單、數(shù)據(jù)準確，不需要繪制DNS的標準曲線，不需要菲林試劑的配制，能及時滿足工藝要求，可隨時根據(jù)檢驗結(jié)果及時調(diào)整發(fā)酵液中糖的含量，對阿維菌素菌種生長有利，菌絲衰老過程得到控制，分泌阿維菌素量提高。在這樣的前提條件下，產(chǎn)量得到了提高。阿貝折光法適合大規(guī)模的生產(chǎn)，并且檢驗人員容易掌握。而DNS、菲林法約需40 min，操作環(huán)節(jié)復(fù)雜、檢驗成本較高。

　　2 討論

　　2.1 實驗過程的注意事項

　　環(huán)境的溫度、發(fā)酵液的溫度對測樣的數(shù)據(jù)影響較大，一定要嚴格控制按照儀器使用方法進行操作，將發(fā)酵液的溫度和環(huán)境溫度控制在25℃在開始測樣，因為物質(zhì)的折射率與密度有關(guān)，溫度不同，密度不同，所以在不同的溫度下測定同一樣品的折射率是不同的，溫度高所測糖濃度偏低，溫度低測糖濃度會偏高。

　　2.2 實際生產(chǎn)運用

　　通過三種方法比較，DNS、菲林法操作步驟多多，得出阿貝折光儀用于阿維菌素生產(chǎn)中間體檢驗，間單快捷、數(shù)據(jù)出具及時準確，能正確指導(dǎo)發(fā)酵工藝人員對發(fā)酵狀況做出正確判斷。并減輕化驗員的勞動強度�；瀺徫坏脑噭┦褂昧繙p少，不用配制菲林試液并進行標定，不用再定期繪制DNS法糖標準曲線圖，在生產(chǎn)過程中檢驗試劑的排放減少，減輕對環(huán)境的污染程度。生產(chǎn)過程中，可以定期對阿貝折光儀所測數(shù)據(jù)進行菲林法、DNS法做對照實驗，觀察數(shù)據(jù)有否偏離。

阿維菌素發(fā)酵過程糖含量測定三種方法比較

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