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用HPLC純化和分離多肽

RP-HPLC在實(shí)驗(yàn)室通常來純化用于研究目的的微克到毫克量的多肽。內(nèi)徑50mm或更大的色譜柱用于純化克級量的用于臨床試驗(yàn)或商業(yè)藥品的重組蛋白質(zhì)。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的放大分離通常包括標(biāo)準(zhǔn)溶劑和離子配對試劑或緩沖液的使用、選擇所需加樣載負(fù)特性的柱子尺寸(見附錄A)、以及優(yōu)化洗脫梯度。

將實(shí)驗(yàn)室分離放大到過程規(guī)模，不僅要包括增加柱子的尺寸和洗脫速率，還包括洗脫溶液的變化、不同離子配對試劑或緩沖液的使用、以及梯度條件的變化。

在所有情況中，實(shí)驗(yàn)室分離的放大可以通過使用用于大尺寸色譜柱的分離材料而得到簡化，這些大尺寸柱子和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模常規(guī)分離所用柱子的分離特性幾乎相同。

分離材料的選擇

產(chǎn)程規(guī)模反相分離的材料能得到和分析型反相色譜柱幾乎相同的分離特性。

VYDAC 300 A的硅膠微粒大小從不到5微米到幾乎30微米不等(圖40)。通過物理冷上漿來分離5到10微米的微粒碎片，以用于分析和實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的制備分離。

VYDAC TP-300 A 孔徑硅膠的粒度分布

　　圖40.硅膠的粒度從小于5微米到30微米不等，有分析、制備和工藝應(yīng)用等粒度級

較大平均粒度的硅膠，被分離出用于制備和過程放大的應(yīng)用。過程放大的反相材料與分析規(guī)模材料具有幾乎相同的蛋白質(zhì)和肽選擇特性，它的加工工藝與分析型大小的硅膠一樣，并通過相匹配的化學(xué)處理鍵合在硅膠上。用5、10和15-20微米粒度材料的色譜柱分離幾種蛋白質(zhì)就說明了這一點(diǎn)(圖41)。三種柱子的蛋白質(zhì)選擇性和保留時(shí)間是一樣的。不同微粒大小的材料的唯一不同點(diǎn)是，大分子材料產(chǎn)生的峰更寬，造成分離度有些丟失。大微粒材料——10-15、15-20或20-30μm——通常用于大規(guī)模純化，因?yàn)樗鼈儽刃》肿硬牧媳阋�，產(chǎn)生柱壓低，而且易于裝進(jìn)大直徑柱子中。另外，在制備型色譜中，色譜柱幾乎總是“超載負(fù)”以得到最大樣品通量(見43頁)。當(dāng)色譜柱“超載負(fù)”時(shí)，大微粒材料和小微粒材料的性能差不多，如圖42所示。雖然用5或10微米的材料比用在樣品低載負(fù)時(shí)用更大微粒材料得到的峰寬和分離度要好很多(2-3倍)，但是在用典型的“超載負(fù)”條件進(jìn)行高進(jìn)樣載負(fù)時(shí)，峰寬只比用較大微粒材料的大20-50%左右。柱子超載負(fù)時(shí)，小微粒輕微的分離度的優(yōu)勢并不能彌補(bǔ)其成本高、柱壓高以及在工藝應(yīng)用中的實(shí)際困難。

放大洗脫條件

放大多肽分離時(shí)要考慮的三個(gè)關(guān)鍵因素是：洗脫溶劑、離子對試劑或緩沖液、以及梯度特性。

洗脫溶劑

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的純化通常使用和分析型色譜一樣的有機(jī)調(diào)節(jié)劑，即乙腈。

離子對試劑或緩沖液

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的純化通常使用和分析型色譜一樣的離子對試劑或緩沖液。

梯度特性

增加柱直徑時(shí)，為了保留分析柱上得到的分離度，必須保持梯度體積的速率為柱體積常數(shù)以維持梯度形狀。比如，同樣長度的直徑22mm柱的體積是直徑4.6mm柱體積的23倍(22除以4.6，平方)。分析柱以1.0mL/min的梯度走30分鐘的體積為30 mL。要把該方法應(yīng)用到22mm柱上，梯度體積將增加23倍，達(dá)690mL。保持梯度時(shí)間不變，流速將增加23倍;延長梯度時(shí)間，流速也會部分地增加。比如，流速為23mL/min走30分鐘，梯度體積為690 mL。但是，以10mL/min的流速走69分鐘能得到同樣的梯度體積，由此得到同樣的梯度形狀和同樣的樣品分離度。在這兩種情況下的分離都能與分析柱上得到的相媲美。實(shí)際上，梯度常設(shè)置得更低——即單位時(shí)間內(nèi)有機(jī)調(diào)節(jié)劑濃度增加較小——以增加分離度，尤其在收集主要多肽時(shí)。

過程放大純化：多于五克的肽

洗脫劑

常用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模色譜的有機(jī)溶劑會引起成本、處理或操作環(huán)境中的安全等問題。乙醇等溶劑在過程色譜時(shí)更適用一些。乙醇相對來說無毒、與水混合時(shí)不易燃、成本低并被FDA等管理機(jī)構(gòu)所熟悉。乙醇目前用于大規(guī)模過程純化。

離子配對試劑或緩沖液

通常用于分析型色譜的離子對試劑不太適用于過程放大色譜。能用于操作色譜的替代離子配對試劑或緩沖液包括乙酸(也能乙�；嚯�，制劑時(shí)又用)和磷酸鹽。乙酸目前用于幾種生物技術(shù)多肽治療劑的分離。

梯度特性

根據(jù)大柱子而放大洗脫梯度的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模純化能用于過程放大純化(見上)，多肽洗脫所用梯度通常都很小。

一針色譜分析中能純化多少肽?

如果RP-HPLC分離的目的是收集純化的多肽以備進(jìn)一步使用，在保持滿意的純度的同時(shí)柱子所能載負(fù)的樣品量就很重要了。制備純化的方法一般是載負(fù)最大可能量的多肽，同時(shí)權(quán)衡以下三個(gè)因素：

通量

給定時(shí)間內(nèi)純化的多肽量。雖然低載負(fù)產(chǎn)生最大的分離度，但每針色譜分析時(shí)純化量較少，通量也較低。

純度

純度用最終純化產(chǎn)物的重量占總重量的百分?jǐn)?shù)來表示。純的多肽通過避免相鄰峰的重合來得到，雖然這會限制柱子能載負(fù)的樣品量。

產(chǎn)量

純化后的多肽占初始多肽總量的百分?jǐn)?shù)。最大化分離度可以在除去雜質(zhì)的同時(shí)，回收載負(fù)的大部分多肽。如果分離度較低，則收集峰的中間部分，這樣就減少了產(chǎn)量。

RP-HPLC柱上的樣品容量有三個(gè)量度：

　　■ 最佳分離度時(shí)的載負(fù)容量;

　　■ 實(shí)際樣品載負(fù)量

　　■ 柱子允許載負(fù)的最大多肽量。

最佳分離度時(shí)樣品載負(fù)能力

色譜分析中，柱子載負(fù)極限通常定義為色譜分析時(shí)峰寬增加不超過10%的分析物最大量。

對大多數(shù)多肽來說，分析柱(直徑4.6mm)在到達(dá)“超載負(fù)”點(diǎn)前，峰寬和分離度保持不變的樣品量在100到200μg 之間(圖43)。樣品載負(fù)大于這個(gè)值時(shí)會形成寬峰，造成分離度降低。

　　圖43.進(jìn)樣量直到200μg時(shí)峰寬仍保持不變。大于200μg(“超負(fù)載”點(diǎn))時(shí)峰寬慢慢變大。核糖核酸酶的實(shí)際進(jìn)樣范圍是200-5000μg。色譜柱：VYDAC 214TP54 (C4, 5 μm, 4.6 x 250 mm) 洗脫液：24-95% ACN+0.1% TFA，30min 樣品：核糖核酸酶

實(shí)際樣品載負(fù)量

制備分離需要通過平衡分離度、產(chǎn)量和純度來最大化通量。通常來說，提高產(chǎn)量是以減少純度和降低通量為代價(jià)的。在實(shí)際中，這往往需要是色譜柱“超載負(fù)”——也就是多肽進(jìn)樣量多于最佳分離度定義的樣品量。隨著樣品載負(fù)增加，多肽的峰寬也隨之增加(圖43和44)，但峰形仍保持對稱。這就允許樣品載負(fù)量可以是定義樣品量的10到50倍，而仍能保持可接受的分離度。

在圖44中，分別進(jìn)樣25、100、200、500和1000微克的核糖核酸酶和溶解酵素，說明了增加樣品載負(fù)對峰寬增加的分離度的影響。在25和100μg的進(jìn)樣量時(shí)(在最佳分離度的范圍內(nèi))，核糖核酸酶和它前面的小雜質(zhì)之間的分離度保持不變(圖44A,B)。進(jìn)樣量超過100μg(“超載負(fù)”點(diǎn))時(shí)，核糖核酸酶和雜質(zhì)的分離度開始降低。200μg進(jìn)樣量時(shí)，峰寬明顯增加，導(dǎo)致分離度降低(圖44C)。500μg時(shí)，分離度顯著降低(圖44D);1000μg時(shí)，雜質(zhì)峰與核糖核酸酶的峰完全重合(圖44E)。

溶解酵素和前面雜質(zhì)的分離度在200μg時(shí)仍保持不變，但之后分離度就逐漸減少了。在500μg時(shí)(圖44D),雜質(zhì)峰只出現(xiàn)在溶解酵素峰肩上，1000μg時(shí)(圖44E)，雜質(zhì)峰和溶解酵素峰就完全重合了。蛋白質(zhì)和雜質(zhì)峰可以通過運(yùn)行一個(gè)更小的梯度提高分離度。

由于核糖核酸酶和溶解酵素的分離度甚至在1000μg時(shí)仍保持良好，而且峰形沒有嚴(yán)重退化，所以在高進(jìn)樣量時(shí)也可能得到分離很好的峰。文獻(xiàn)中有很多高負(fù)載時(shí)純化多肽的實(shí)際例子。其中有一例就是用5 x 30 cm的色譜柱純化1.2克合成多肽混合物。據(jù)個(gè)人所知，曾有報(bào)道用5 x 25 cm色譜柱分兩步純化5克的合成多肽。

多肽最大結(jié)合量

多肽在反相色譜柱上的最大結(jié)合量取決于多肽的大小和性質(zhì)。小肽的結(jié)合量約為每克分離材料10mg肽——在4.6 x 250 mm色譜柱上結(jié)合25mg。較高的肽結(jié)合量為每克分離材料10-20mg蛋白質(zhì)，這取決于疏水腳面積占整個(gè)分子量的比例。

雖然接近色譜柱最大結(jié)合量的樣品量分離度很小，但它們能對多肽樣品簡單、快速地脫鹽。

通量和分離度的優(yōu)化方法

樣品濃度

樣品的濃度會影響相鄰洗脫的多肽的分離度。稀釋的樣品比濃縮的樣品好像能更好地分布在色譜柱表面，由此產(chǎn)生一些更好的分離度。建議：使用稀釋的樣品以提高分離度和進(jìn)樣量。

使用小梯度

相鄰洗脫的多肽之間可以通過使用較小的梯度斜率提高分離度。常通過延長梯度時(shí)間來達(dá)到這一點(diǎn)。建議：采用較長的洗脫時(shí)間和小梯度以獲得相鄰洗脫峰的分離度。

增加柱體積

由于進(jìn)樣量是色譜柱體積的函數(shù)，所以增加色譜柱直徑或柱長都可以增加進(jìn)樣量。重要的是柱體積，而不是柱直徑或柱長。

使用大微粒吸附劑

當(dāng)色譜柱“超載負(fù)”時(shí)，微粒大小對獲得分離度來說就不那么重要了(圖42)。小微粒材料在“超載負(fù)”條件下的分離度比大微粒材料只有好一點(diǎn)點(diǎn)，但其成本高、柱壓高、小微粒材料柱子制備困難等使其對大多數(shù)制備分離來說不實(shí)用。

有效進(jìn)樣量

在溶劑中進(jìn)樣并不影響多肽的吸附。這一般意味著保持有機(jī)質(zhì)含量低于把多肽從色譜柱上洗脫下來的所需的含量。但是，有些樣品中的溶劑能提高進(jìn)樣量。

生物活性與反相HPLC

蛋白質(zhì)的生物活性取決于它的三級結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)的永久性斷裂會使蛋白質(zhì)失去活性。

RP-HPLC能破壞蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)，這是由洗脫所用的疏水性溶劑或是由蛋白質(zhì)與疏水材料表面的相互作用造成的。生物活性喪失的量取決于蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和所采用的洗脫條件。生物活性的喪失可以通過適當(dāng)?shù)纳V后處理來減少到最小。小肽和非常穩(wěn)定的蛋白質(zhì)與大分子酶相比更不容易失去生物活性。

蛋白質(zhì)變性

蛋白質(zhì)在疏水性表面的動力學(xué)變性很慢。減少蛋白質(zhì)在色譜柱中的保留時(shí)間一般可以減少生物活性的喪失。

溶劑影響

有些溶劑比其它溶劑更不易引起生物活性的喪失。異丙醇是保持生物活性的最好溶劑。乙醇和甲醇有點(diǎn)差，乙腈則引起最大的生物活性喪失。

穩(wěn)定因子

加進(jìn)色譜洗脫液中的酶的輔助因子等穩(wěn)定因子可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)，減少生物活性的喪失。

保持或恢復(fù)生物活性的最重要的因素是柱后樣品處理。將收集后的蛋白質(zhì)用穩(wěn)定緩沖液溶解能使蛋白質(zhì)重新折疊起來。HIV蛋白酶就是一例(圖45)。

RP-HPLC后仍有生物活性的例子

胰島素

反相色譜已被用于純化消化蛋白質(zhì)的胰島素。

脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)

用反相色譜純化的脊髓灰質(zhì)炎病毒蛋白質(zhì)能引起兔子體內(nèi)特定抗體的生成，說明其仍保留生物活性。

花粉過敏原

猶大墻草的主要蛋白質(zhì)過敏原在用RP-HPLC純化后仍保留IgE粘合能力，因?yàn)樗怯玫蜐舛纫译嫦疵摰摹?/P>

HIV蛋白酶

HIV蛋白酶經(jīng)反相色譜和色譜后處理仍保持大部分的生物活性，能夠重新折疊(圖45)。

使用反相HPLC純化商業(yè)多肽治療劑

經(jīng)反相色譜后生物活性并沒有不可避免地消失的最明顯證據(jù)是，在純化商業(yè)藥品時(shí)對幾種商業(yè)生物治療劑的反相色譜分析。

　　■ 促血紅細(xì)胞生長素可以用反相色譜純化，這是純化過程的一部分。

　　■ 集落刺激因子(Leukine)是一種商業(yè)多肽治療劑，用反相HPLC作為其純化過程的一部分。

　　■ 在生產(chǎn)人類重組改構(gòu)胰島素中使用反相色譜純化。

盡管反相色譜會造成一定程度上三級結(jié)構(gòu)和生物活性的喪失，但在大部分情況下，這種生物活性的喪失可以通過使用最佳色譜條件或色譜后處理來緩和或消除。

大規(guī)模純化的例子

實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的純化

文獻(xiàn)中已有使用RP-HPLC純化合成多肽的一些例子。其中一個(gè)例子是用RP-HPLC分兩步從1.2克合成混合物中純化出128mg的促性腺激素(GnRH)拮抗劑(圖46)。該過程如下(詳見參考文獻(xiàn)46)：

　　1 在5微克、4.6 x 250 mm色譜柱上用三乙酰磷酸鹽和乙腈建立洗脫條件;

　　2 在5 x 30 cm色譜柱上進(jìn)樣合成多肽，柱子用15–20 μm的與步驟1柱子中的5微米材料相當(dāng)?shù)奈絼┭b填，并用乙腈和三乙酰磷酸鹽洗脫;

　　3 分析收集組分的純度和產(chǎn)量，合并最佳組分以備脫鹽化和最終純化;

　　4 稀釋，在同一柱子上重新進(jìn)樣;

　　5 用乙腈和TFA洗脫以除去不揮發(fā)的磷酸鹽，進(jìn)一步提高分離度;

　　6 分析收集組分的純度和產(chǎn)量;

　　7 合并最佳組分，最終得到128毫克的促性腺激素(GnRH)拮抗劑，純度為99.7%。

圖46.進(jìn)樣純化128mg合成肽，促性腺釋放激素拮抗劑1.2克合成混合物，用5 x 30 cm色譜柱，填料VYDAC 218TPB1520(C18, 15–20 μm)，用含磷酸三乙基胺的乙腈水溶液洗脫。

反相HPLC純化中有毒微粒的除去

在制備大量治療性蛋白質(zhì)過程中插入反相色譜分離步驟的一個(gè)好處是可以從蛋白質(zhì)“湯”中除去或清除病毒。

用HPLC純化和分離多肽

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