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液相色譜法測定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

　　脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)又名嘔吐毒素，是一種單端孢霉烯族毒素。主要由禾谷鐮刀菌和粉紅鐮刀菌產(chǎn)生。DON污染糧谷的情況非常普遍。世界各地均有報道，特別在中國、日本、美國、阿根廷和南非。在我國胃癌、食管癌等惡性腫瘤高發(fā)區(qū).DON是居民飲食中主要的污染霉菌毒素之一。DON主要在田間侵染小麥、玉米等谷類作物，當人攝入了被DON污染的食物后。會導致厭食、嘔吐、腹瀉、發(fā)燒、站立不穩(wěn)、反應遲鈍等急性中毒癥狀，嚴重時損害造血系統(tǒng)造成死亡。

　　DON化學名稱為3，7，15一三羥基一12，13一環(huán)氧單端孢霉一9一烯一8一酮，為無色針狀晶體。熔點為151。153℃。其化學性能非常穩(wěn)定，具有較強的熱抵抗力和耐酸性.在pH值10.O條件下。100℃加熱60min部分被破壞，120℃加熱30 min和170℃加熱15 min完全被破壞【”。目前，測定糧谷作物中的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的方法很多，如薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、酶聯(lián)免疫法(ELISA)等。本文采用了液相色譜法，使用海能LC7000液相色譜儀配紫外檢測器和C18親水性分離柱，不僅獲得了準確的測定結(jié)果.而且極大地提高了工作效率。

　　l 材料與方法

　　1.1儀器

　　海能LC7000液相色譜儀(配備紫外檢測器)，7mILOGY嘔吐毒素專用凈化柱TC—T200，C18親水性分離柱，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，高速均質(zhì)機，真空泵，小型粉碎機。

　　1.2試劑

　　乙腈(Merck，色譜純)，甲醇(Merck，色譜純)，嘔吐毒素標準品(FERMENTEK LTD)。

　　1.3 操作步驟

　　(1)提取稱取粉碎過篩樣品25.O g于均質(zhì)杯中，加入100 mL y(乙腈)：y(水)=84：16提取液，于高速均質(zhì)機上均質(zhì)4 min，靜置。

　　(2)凈化濃縮取2 mL樣品提取液上清液到凈化小柱頂端，向下推活塞，使溶液全部過柱，收集凈化后溶液放入100 mL標準磨口蒸發(fā)瓶中.取出注射器，加入8 mL y(乙腈)：y(水)=84：16提取液到柱頂端，將溶液徹底過柱，合并凈化液，于60℃減壓蒸干。用2 mL流動相定容。

　　1.4測定

　　色譜條件：C18親水性分離柱(250×4.6 mill，5斗m)，柱溫箱40℃，紫外檢測器波長220 nm，流動相：y(水)：y(甲醇)：y(乙腈)=92：4：4，流速1.5 mL/rain，進樣量20斗L。標準曲線的繪制：使DON質(zhì)量濃度分別為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00ug/mL，將該標準系列分別進樣20燦L，以DON的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

　　1.5驗證

　　(1)空白樣品制備取空白樣品，依據(jù)樣品的處理方法進行處理。

　　(2)回收率及精密度試驗取空白樣品。加入不同體積DON標準儲備液，使其最終進樣液理論質(zhì)量比分別為100、300、1 000 Ixg/kg。每個質(zhì)量比取5個平行樣，根據(jù)樣品的處理方法進行處理。

　　2 結(jié)果

　　2.1定性分析

　　DON標準樣品定性分析色譜圖見圖1。

　　由圖l可以看出DON保留時間為14.095 min。

　　2.2定量計算

　　樣品中DON含量為

　　式中：x——樣品中DON的含量，ug/kg;C——由標準曲線查得進樣液質(zhì)量濃度，ug/mL;樣品質(zhì)量，g

　　2.3標準曲線

　　由圖2可見線性關(guān)系為Y=20.78521X(R=0.99987)，根據(jù)信噪比3倍峰面積，計算出本方法的

　　最低檢出限為50ug/kg。

　　2.4 方法驗證

　　2.4.1專屬性

　　從圖3可見。在DON的出峰時間14.095 min左右沒有雜質(zhì)干擾峰，表明本方法專屬性很好。

　　2.4.2 回收率及精密度實驗

　　取兩組不同含量的樣品各6個.分別確定方法的精密度。結(jié)果見表1。

　　取同一樣品，分別加入不同質(zhì)量比的標準樣品，測定回收率.結(jié)果見表2。

　　從表2可見.該檢測方法回收率為90.7%-98.9%，可以滿足分析的需要。

　　3討論

　　3.1提取方法對回收率的影響目前，采用較多的提取液是y(乙腈)：y(水)=84：16，但提取方法卻各不相同，本方法則采用高速均質(zhì)4 rain。用4種常見的提取方法對添加同樣質(zhì)量濃度0.50 la,g/mL的樣品進行提取，測定其回收率，測定結(jié)果見表3。

　　由表3可以看出，振蕩、超聲、磁力攪拌提取方法的平均回收率只有70%左右，不能滿足分析的需要，而高速均質(zhì)法可使平均回收率達到95.9%。作者曾進一步改變高速均質(zhì)的時間來對比回收率，實驗結(jié)果表明，隨著均質(zhì)時間的延長回收率有小幅上升，當均質(zhì)時間大于4 min后�；厥章薀o明顯提高。故本方法確定的最佳提取方式是高速均質(zhì)4 min。

　　3.2液相色譜法與氣相色譜法、酶聯(lián)免疫法測定谷物中DON的效率及不確定性比較GB/T5009.111-20031第二法中規(guī)定采用酶聯(lián)免疫法(ELISA)，而現(xiàn)在氣相色譜檢測方法也倍受關(guān)注。將這3種方法在檢測效率及不確定性方面做了比較2，見表4。

　　3種方法比較表明：氣相色譜法需要的檢測時間最長，液相色譜法需要的檢測時間最短;從對檢測環(huán)境的要求來比較。液相色譜法和氣相色譜法都對環(huán)境溫度不做要求。而酶聯(lián)免疫法的穩(wěn)定性受環(huán)境溫度影響較大;從操作時間的要求來比較，液相色譜法和氣相色譜法因為在每個操作步驟中沒有較多的時間上的要求，所以不會因為處理樣品數(shù)量多而造成前后樣品反應時間不同而形成的誤差，而酶聯(lián)免疫法由于每步受到嚴格的時間限制，所以每批不可處理太多樣品。以免產(chǎn)生誤差。從而使檢測變得繁瑣。

　　比較3種方法的效率不確定性后可以看出.本方法測定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇比氣相色譜法和酶聯(lián)免疫法具有優(yōu)勢。

　　4 結(jié)論

　　通過實驗建立了一種測定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的液相色譜方法.回收率高、精密度和準確性好。較氣相色譜法和酶聯(lián)免疫法具有很高的檢測效率，而且對環(huán)境的要求比較低，操作簡單易行。

液相色譜法測定谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇

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